Często zadawane pytania dotyczące uszkodzonych komórek

1. E. coli ekspresjonuje obce białko. Po sonikacji zawiesza się w PBS zawierającym 1% tryton-X-100. Efekt ultradźwiękowy jest lepszy. Efekt 1% Triton-X-100 jest nadal oczywisty. Działają też inne bakterie, takie jak Streptomyces. Po ekspresji zrekombinowanego białka, komórki zostały rozbite przez rozerwanie komórek ultradźwiękowych, stosując łaźnię lodową, 400 w, i zgniecione przez 2s przez 1s, ale duża ilość piany została wygenerowana w krótkim czasie, co wpłynęło na moc kruszenia. Zarówno bufory pbs, jak i tris były takie. Czy fragmentacja jest niekompletna, a docelowe białko znajduje się w tych nieprzerwanych komórkach, co powinienem zrobić?

Analiza: Bańka zostanie wygenerowana, ponieważ pozycja sondy nie jest dobrze umieszczona; sonda musi znajdować się blisko dna, około 0,5-1 cm; moc będzie się różnić w zależności od instrumentu, ale można obserwować poziom cieczy, występują fluktuacje, ale nie są zbyt silne; możesz wybrać komórki ultradźwiękowe Kruszarka jest zepsuta na 3s przez 10s i zepsuta na 20-30 razy. Należy również zauważyć położenie klaksonu. Jeśli dźwięk jest nieprawidłowy, należy go wyregulować w czasie; biorąc pod uwagę stężenie bakterii. Spróbuj zwiększyć objętość podczas kruszenia, siła Zui nie powinna przekraczać 60%; próbuj przełamać 8s przez 8 s, dla niektórych białek bakteryjnych trudno jest rozproszyć białko, aby spowodować denaturację białka, aby wytworzyć bąbelki, które mogą zostać zatrzymane na nieco dłużej. Białko znalezione w postaci ciałek inkluzyjnych.

2. Jakie są warunki sonikacji Streptomyces (promieniowców)?

Analityczne: promieniowce należą do (G + C) procentu molowego (% mol) grupy rozgałęzień Gram-dodatnich (Eubacteria) na drzewie filogenetycznym systemu prokariotycznego, który ma charakterystykę molekularną i biologiczną unikalną dla prokariontów. Jednak w różnych grupach skład chemiczny ściany komórkowej jest bardzo zróżnicowany. W badaniu ultrasonograficznym E. coli stosuje się 400 W, a metoda przełamywania 5s przez 5 s jest skuteczna, ale jest stosowana na Streptomyces i nie ma ona wpływu z powodu różnicy w składzie ściany komórkowej. Wstępne przędzenie Streptomyces (promieniowców) jest ogólnie skonfigurowane do określonego stężenia zawiesiny bakteryjnej. Specyficzne warunki dla kruszenia za pomocą ultradźwiękowego urządzenia do usuwania komórek obejmują: zbieranie bakterii w 24-godzinnym roztworze hodowli przy 5000 r / min przez 5 minut w celu zebrania komórek; przemywanie buforem pH 7,5 Na2HPO-NaH2PO 3 razy, a następnie Komórki sformułowano w zawiesinę bakterii 1: 3 z użyciem bufora. Umieszczony w dużej plastikowej probówce o pojemności 40 ml; umieść dużą plastikową probówkę w łaźni lodowej i zmiażdż ją za pomocą ultradźwiękowego urządzenia do rozpraszania komórek (moc 200 W, sonda 1/2 ", kruszenie przez 30 s, przerywane 30 s), roztwór do kruszenia przy 12 000 obr / min Wirówka z dużą prędkością przez 30 min, zbierać szczątki komórek i supernatant, komórki myjące można również przemyć raz wstępnie ochłodzoną solanką lub Tris-HCl przy pH 8. Ponadto, dawka ultradźwiękowa zmienia się znacznie w zależności od ilości próbki i bakterii. 600w, rozgniatany przez 5s, zatrzymany na 5s, kąpiel lodowa i końcowe stężenie 1 mM PMSF W celu określenia odpowiedniego natężenia ultradźwiękowego i częstotliwości, należy sprawdzić, czy bakterie są całkowicie zerwane w dowolnym momencie.